理性分子設計

理性分子設計主要是在計算機中(in silico)完成。通過計算機建模(computational modeling)預測蛋白質活性位點，考察某基因突變對目標蛋白穩定性、摺疊以及與底物結合的影響，從而對蛋白質進化進行設計指導和模擬篩選實驗，提高實驗的成功率。

基本介紹

• 中文名：理性分子設計
• 外文名：rational design of biomolecules

發展簡介

20 世紀 90 年代以後，計算能力和分子模擬技術的高速發展使研究者能夠從微觀的角度認識分子之間的作用模式，以及結合過程中力和能量的變化，為高親和性配基的篩選提供了一條新的途徑。分子模擬軟體融合了最先進的計算機軟硬體與圖形技術，集成了計算化學和分子圖形學的最新成果，並將化學信息管理系統作為其貫穿整個軟體的基礎。它能在三維水平上了解化合物的分子結構和各種重要的微觀性質（如靜電勢、疏水場等）與所期望的巨觀性質（如親和性）之間的定量關係。利用分子模擬軟體對配基與生物大分子之間的親和性進行預測，能夠提高合成化合物的命中率，減少化合物的合成數目，雙向降低合成與篩選的成本，縮短研究與開發的周期，因此具有強大的經濟效益。1993 年 Lowe 等根據胰蛋白酶類似物活性部位胺基酸殘基與精氨酸和賴氨酸的親和作用，首次利用理性設計的方法對染料配基進行改造，大大提高了其親和性。此後，越來越多的實驗人員開展了套用理性設計的方法進行高親和性配基的篩選研究。

配基的理性設計藉助於計算機分子模擬技術，整合了天然蛋白質分子的特異性和合成配基在穩定性方面的各種優點，為高親和性配基的篩選提供了一條新的思路，成為最具生命力的設計方法。理性設計親和配基的研究歷史雖然較短，但其發展對於親和色譜技術的工業化套用有著重要的意義。目前常用的配基理性設計方法共有以下三種：基於結構的理性設計方法，基於功能的理性設計方法以及理性設計結合組合庫技術的方法。

基於結構的理性設計方法

基於結構的理性設計方法是在自然界中存在的配基或目標蛋白結構的基礎上，利用分子模擬軟體改進或開發一種新的與目標蛋白具有更高親和力的配基。近年來，生物信息學和計算機分子模擬技術的飛速發展為蛋白質功能和高級結構的解析提供了更為廣闊的平台。截至 2008 年 7 月，已有 51, 000 個蛋白質的三維結構信息利用實驗方法測得，這些信息都存儲在美國 Brookheaven 構建的蛋白 質 結 構 數 據 庫 （ Protein Data Bank, PDB ）（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中，供全世界的研究人員免費下載。

為基於目標蛋白的三維結構，利用計算機理性設計親和配基提供了便利，使其成為更加快速的獲得高親和性肽配基的有效方法。該方法一般包括以下步驟：

1． 通過蛋白質資料庫或同源模建的方法獲得目標蛋白質的相關結構信息。

2． 基於經驗或分子模擬軟體分析找到潛在的配基結合位點，這個位點可能是蛋白質的活性點，也可能是它的天然互補配基結合位點，或者是溶劑暴露區域等。

3． 建立一個含有大量候選分子的資料庫，也可以利用商業化的資料庫，如常用的劍橋結構資料庫（Cambridge Structural Database，CSD）和現有化學品目錄資料庫（Available Chemicals Directory，ACD）等。

4． 利用分子對接軟體（FlexX, Dock, Autodock 等）進行配基的篩選，獲得與目標蛋白具有較高親和性的配基。

5． 最後利用分子顯示和分子性質分析軟體評價所獲得的配基和目標蛋白的親和性。

利用基於結構的理性設計方法篩選親和配基的研究已經取得了一定的研究進展。Baumann 等利用分子模擬在豬胰腺 α-澱粉酶的三維結構的基礎上利用分子對接軟體從含有 53 個芳基的糖類化合物中篩選出 23 個候選化合物，然後利用核磁共振技術進一步篩選獲得一個與該目標蛋白具有較高親和性的化合物，合成並固定化此肽配基製得親和層析柱，利用同源建模的序列分析獲得了人單克隆抗體片段的三維結構，然後利用分子對接軟體從 ACD 資料庫中篩選出 24 個化合物作為候選分子，再利用表面等離子共振和 STD-NMR 技術進一步篩選獲得與目標蛋白具有高親和性的配基，最後利用親和色譜驗證了該配基與單克隆抗體片段的親和性。另外，如果已知待研究的目標蛋白-自然配體複合物的三維結構，也可以從已知的與待分離的生物大分子具有親和作用力的配體小分子出發，通過結構改造、修飾等方法獲得親和力更高的配基。Platis 等以鎖鑰原理為基礎理性設計了人愛滋病毒單克隆抗體 2F5 的親和配基，同時利用親和色譜實驗證明了該配基與目標蛋白具有較高的親和力。

基於功能的理性設計方法

如果待分離目標蛋白的三維結構未知或也不能通過同源建模技術獲得，則可以採用基於功能的理性設計方法來設計目標蛋白的親和配基。該方法是在自然界中存在的親和作用體系的基礎上，利用已知的配體或抑制劑的功能基團來設計新的親和配基。利用基於功能的理性設計方法篩選肽配基有兩種途徑：一種途徑是通過研究目標蛋白的底物、抑制劑或輔酶的形狀或物理化學性質（疏水性，靜電勢）來設計一種與目標蛋白具有高親和性的配基；另外一種途徑是在目標蛋白的活性部位所暴露殘基的基礎上，根據理化性質互補的原則或引進一些特殊的功能基團來理性設計配基。因此，該方法的實質是在經驗知識的基礎上模仿自然界中存在的配體。例如，氨苯磷酸鹽是鹼性磷酸酯酶的親和配基，而苄脒基團常被用來作為配基來分離純化胰蛋白酶類蛋白酶，Burton 等利用該思路針對舒緩激肽設計了特異的親和配基，利用分子模擬軟體 Macromodel研究了結合於酶活性部位的二肽 Cys-Lys 與酶的相互作用模式，以 Phe-Arg 二肽為模板設計出以苯甲脒和苯丙氨酸為活性端，以三氮嗪環為母體化合物的親和配基，其大小、形狀、極性特徵與模板二肽相當，能很好的結合於受體活性部位，並且結構穩定，不易降解。實驗結果表明這種配基能從胰腺粗提取物中特異結合舒緩激肽而不結合胰蛋白酶和凝乳蛋白酶，其純化倍數達到 110 倍。

結合理性設計和組合庫技術的方法

與大規模的組合庫篩選技術以及完全基於目標蛋白或配體的結構或功能信息和設計者經驗的親和配基設計方法相比，結合理性設計和組合庫技術篩選配基已經成為一種更加高效和理性的篩選方法。它首先利用計算機的分子模擬技術獲得目標蛋白或其自然配體的儘可能詳盡的結構信息，把合成的注意力更多地集中在具有相關結構或化學特性的潛在配體上，以此構成一個小規模的配體庫用於實驗篩選，研究人員可以從中獲得親和性較高的配體；同時，通過分析篩選結果與配體結構的定性關係獲得一些更為直觀的經驗，用於指導配體化合物的結構最佳化。由於單純的規模化篩選目的性不強，篩選結果很大程度上取決於所建肽庫的容量和質量；而單純的計算機輔助的設計過程不能將隨後的配基固定化過程以及複雜的化學環境、動態的結合模式等諸多可變因素考慮在內。

目標蛋白的結構和功能信息與組合配體庫和高效篩選方法的結合，在很大程度上彌合了經驗與實際過程之間的偏差，這種設計思路將對親和色譜的規模化套用產生積極的影響。基於這種方法的配基篩選過程一般包括以下步驟：

1．在目標蛋白三維結構（利用 X-ray，NMR 或同源建模獲得）或功能的基礎上選擇合適的結合位點。

2．利用分子模擬軟體理性設計一些與目標蛋白結合位點的結構和物理化學性質互補的結構片段。

3．以這些結構片段為先導片段利用組合庫技術（固相合成技術）來合成一系列的候選化合物。

4．以目標蛋白為靶標篩選與其具有高親和性的配基。

5．合成該配基，固定化後製得親和層析柱，利用其來分離目標蛋白。若其親和分離效果不好，重複第四步進行重新篩選。

Lowe 研究組已經利用這種方法開發出一系列的三嗪類似物的配基。Roque等首先利用分子模擬工具分析了前導蛋白質L和人抗體輕鏈之間的相互作用，利用理性設計的方法獲得了與抗體或其小片段（Fab 或 scFv）具有親和作用的12 個先導化合物分子，然後利用固相合成技術生成一個化合物庫，通過篩選獲得與目標蛋白具有高親和性的化合物。合成並固定化該化合物製得親和層析柱，用於人免疫球蛋白 G 木瓜蛋白酶消化液中 Fab 的分離純化，純度達到 96~98%。Melissis 研究小組利用該技術成功地設計了與 Pfu DNA 聚合酶和 Taq DNA 聚合酶的核苷酸類似物配基，並獲得了非常好的分離效果。

理性設計提高蛋白質熱穩定性的策略

對蛋白質進行熱穩定性改造的傳統方法為定向進化，即在實驗室中模擬自然界的進化過程，首先針對某一蛋白質的基因，通過特定的誘變與重組技術對其進行改造，構建突變文庫，然後再根據突變體的熱穩定性的狀況，篩選出熱穩定性較好的突變體。該方法不需要考慮蛋白質結構與功能之間的關係，但是需要構建大規模的突變體庫，並且需要建立靈敏有效的高通量篩選方法，因此往往會耗費大量的人力、物力及財力。而隨著人們對蛋白質結構研究的深入，大量的熱穩定性蛋白質被發現以及對影響蛋白質熱穩定性機制的了解，使得人們期待著採用一種理性設計的策略對蛋白質進行合理性設計而改變其熱穩定性。所謂蛋白質理性設計是基於對蛋白質結構和功能關係的認識，通過定點飽和突變技術改造蛋白質的一種方法。

進行蛋白質的理性設計意味著在突變之前，人們需要進行仔細的考慮與推測，選擇特定位點進行突變。該個方法通常要求有蛋白質三維結構，並且要求對蛋白質的催化機理、結構和功能的關係以及酶的熱穩定性機制有深入的了解。由於人的理性參與，可以在較短的時間內設計並得到性質改善的突變體。理性設計獲得的結果可以反過來擴充人們對於蛋白質結構和功能的認識。但是由於目前人們對酶的催化機制以及酶熱穩定性機制的認識有限，理性設計的套用範圍受到很大的限制。到現在為止套用比較成功的方法主要有以下幾種:

同源比對的策略

研究發現，在嗜熱蛋白質與其同源的中溫蛋白質之間往往具有較高的相似性( 通常可達到40% ～ 80%) ，因此，可以通過比較熱穩定性高的蛋白質與熱穩定差的蛋白質的序列，找出與熱穩定性相關的胺基酸位點，然後對其進行突變，進而可以提高中溫蛋白質的熱穩定性。其中嗜熱蛋白質可以為來源於已知熱穩定性質的蛋白質的同源蛋白或來源於嗜熱菌基因組中編碼的同源蛋白。套用同源比對策略，通過比較來源於Xanthomonas campestris 的中溫果膠裂解酶( pectate lyase) 與4 條嗜熱果膠裂解酶的序列，發現這4 個嗜熱果膠裂解酶的序列相同，但其與中溫果膠裂解酶序列不同，主要集中在9 個位點。通過將中溫果膠裂解酶中的這9 個位點突變成嗜熱果膠裂解酶中的胺基酸，結果顯示有6 個突變體的半衰期比野生型增長，其中有一個單點突變R236F 的半衰期是野生型蛋白質的23 倍。

蛋白質表面電荷的最佳化策略

蛋白質通常是在內部形成一個疏水核心，而在其表面分布著一些帶電荷的胺基酸，這些分布在蛋白質表面的帶電荷胺基酸之間可以通過電荷之間的相互作用，給蛋白質形成一個保護網，增加蛋白質對高溫的抗性。因此通常可以通過對蛋白質表面帶電荷的胺基酸進行重新設計最佳化，使其表面的電荷分布更加合理，從而提高其熱穩定性。現已有研究人員設計出Modeller 軟體可用於計算蛋白質表面電荷的分布狀況，模擬蛋白質的結構及突變體的結構，用遺傳算法來篩選最優的表面帶電荷胺基酸的分布。

該軟體現已套用於多種蛋白質的改良，結果發現這些表面電荷重新設計的蛋白質的熱穩定性較野生型蛋白質均有一定的提高，表明該方法有一定的適用性。

基於二硫鍵的設計策略

在蛋白質特定位置上的二硫鍵可以對蛋白質的熱穩定性起到至關重要的作用。它主要通過降低蛋白質解摺疊狀態的熵值來達到穩定蛋白質結構的目的。通過認真分析二硫鍵中各個原子之間的距離及鍵角等相關信息，可知在蛋白質的二硫鍵中，Cβ-Sγ-Sγ之間的鍵角為104. 15°。利用該信息設計的二硫鍵設計軟體( Disulfide by Design) ，可以分析蛋白質的結構中哪些胺基酸之間可能會形成二硫鍵，並進而通過在蛋白質的特定位置引入二硫鍵提高蛋白質的熱穩定性。

溫度因子的設計策略

溫度因子( B-factor) 的概念起源於晶體研究，主要是用來體現晶體中原子構象狀態的一種“模糊度”( diffusion) 。這個“模糊度”實際上反映了蛋白質分子在晶體中的構象狀態。B-factor 越高，“模糊度”越大，相應部位的構象就越不穩定或柔性越強。在晶體學數據中，B-factor 一般是以原子為單位給出的，通常我們將其換算成相應胺基酸殘基的B-factor，從而可以分析胺基酸殘基的構象穩定性或其柔性。研究發現，將蛋白質結構中B-factor 值較高的胺基酸突變後，部分突變體的熱穩定性可以得到明顯的提高。因此有些研究也利用機器學習算法來預測B-factor，從而輔助突變位點的設計。

SCHEMA 模擬法

DNA shuffling 是一種有效的非理性設計方法，它可以將多個有益突變融合起來，形成一個更加完美實用的分子。SCHEMA 模擬法由Voigt等於2002 年提出，它的思路正是來源於這種DNA 隨機重組的方法，該方法通過對蛋白質結構進行分析，將蛋白質分成若干個獨立的小模組，使小模組之間的相互影響減少到最小，並利用該信息來確定蛋白質之間可以進行重組的位點。通過該方法可以將嗜熱蛋白質中和嗜熱相關的模組引入到中溫蛋白質，進而改善蛋白質的熱穩定性。該方法已成功的套用到纖維素酶的分子改良。